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奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定与药敏试验
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发布日期:2018-3-7 8:56:42 来源:河南省饲料工业协会 作者:

李凤琴:河南省获嘉县动物卫生监督所

王明武:河南省获嘉县动物卫生监督所

 

 

  要:本试验通过对乳房炎的分离培养鉴定,一共分离出8株细菌,经过不同细菌的细菌形态、染色特性和生化特性等鉴定表明,分离的8个菌株中,无乳链球菌有5株,大肠杆菌有3株。用15种药物对这8株细菌进行敏感性试验,结果表明, 复方阿莫西林和头孢氨苄对大肠杆菌和无乳链球菌最敏感;氨苄青霉素、丁胺卡那霉素和新霉素也有良好的抑菌效果;磺胺类药物几乎没有抑菌作用。该牧场选择复方阿莫西林、头孢氨苄为临床治疗场内奶牛乳房炎的药物,最终取得了良好的治疗效果。

关键词:乳房炎,病原菌,分离鉴定,药敏试验

乳房炎一直是奶牛场危害大、花费高、防治难的重大疾病之一,不但造成牛奶产量和质量下降,影响奶牛养殖业的经济效益,同时,乳房炎的存在也使乳品安全面临着严峻的考验。

乳房炎是指奶牛乳腺受到微生物、物理、化学等刺激所发生的一种炎性变化,其特点是乳汁发生理化性质变化,特别是白细胞增加,以及乳腺组织发生病理学变化[1]。根据其表现形式通常可以将乳房炎分为临床型乳房炎和隐性乳房炎,隐性乳房炎是奶牛乳房炎中最常见的一种乳腺内感染,乳房乳汁没有肉眼可见的异常,只有借助特殊的检测方法才能检测出乳汁的一些变化[23]。临床型乳房炎则有明显的症状。许多隐性乳房炎直到转变成临床型乳房炎才被发现主要是因为其临床症状不明显而被忽视,故在奶牛群中此病存在较为广泛,造成的损失也很大。近几年,我国的一些地区进行了关于奶牛乳房炎的普查,结果表明北京奶牛乳阳性率为31%,浙江的奶牛乳区阳性率36%-55%,上海的奶牛乳区阳性率为38.5%-51.2%[4,5]

各种各样的微生物分布在奶牛的生活环境中,其中导致奶牛乳房炎的病原微生物大致可以分为两类:一类是革兰氏阳性菌,包括葡萄球菌、链球菌和肠球菌等;另一类是革兰氏阴性菌,主要是大肠菌群。奶牛乳房炎的病原微生物的种类有很多,但是从文献报道中我们可以知道奶牛乳房炎的病原微生物大多是大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌[6,7]。其中金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、牛支原体等是引起乳房炎最主要的传染性病原菌,这些病原体通过很多途径感染牛只 。环境性病原菌有大肠杆菌、变形杆菌、肺炎克雷伯菌等,这些病原菌普遍存在于环境中,环境条件恶劣和乳头损伤的条件下造成病原菌感染的机率最大。

此外,遗传因素,环境因素,疾病继发以及饲养管理不当等多方面因素也会引起致病菌扩散从而引发奶牛乳房炎。杨章平报道了奶牛隐性乳房炎的发生与饲养管理的关系很大,发生率随着季节不同而不同,在第三季度隐形乳房炎发生率是最高的 [8]

本试验是在我县某奶牛场采集材料,由于各方面的因素,其场奶牛乳房炎的发病情况也日益升高,多次治疗不见彻底好转再加上不按照规定使用抗生素,不少病原微生物产生不同程度的耐药性,这给乳房炎的治疗增加了不少难度。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源

我县一奶牛牧场挑选8头患有乳房炎病牛,采集奶样10份。采样前先用清水清洗乳房,清洗消毒后用消毒纸巾擦干,弃去前3把奶,采集约15ml奶样于灭菌瓶中,加盖封紧并做好标记,将采集好的奶样迅速放入冰水中或冷藏,尽快检测。

1.1.2 培养基

普通琼脂培养基(上海哈灵生物有限公司),血琼脂培养基(天津市凯通化学试剂有限公司),麦康凯培养基(北京奥博星生物技术责任有限公司),伊红美蓝培养基(北京奥博星生物技术责任有限公司),M-H琼脂培养基(天津市凯通化学试剂有限公司)。

1.1.3  主要仪器

本试验用到的仪器主要有:冰箱(海尔),光学显微镜(北京光电仪器公司),生化培养箱(上海跃进医疗器械厂),超净工作台(天津医疗设备仪器厂),高压灭菌箱(香港安捷来国际股份公司),微量生化管(杭州天和微生物试剂有限公司)等。

1.1.4  药敏纸片

头孢三嗪、青霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、头孢氨苄、丁胺卡那霉素、恩诺沙星、强力霉素、磺胺甲噁唑、红霉素、新霉素、呋喃唑酮、复方磺胺TMP、链霉素、头孢唑啉,均购于杭州微生物制剂厂。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离与纯培养

10份奶样摇晃均匀,在超净台内,用无菌接种环以划线法接种到血琼脂培养基平板上,置于37℃的生化培养箱里培养24h,再挑取可疑菌落选择性接种于麦康凯琼脂平板、伊红美蓝琼脂平板、营养琼脂平板、血琼脂平板上进一步培养。同时做好记录。

1.2.2  涂片染色镜检

滴一滴生理盐水于载玻片中央,用无菌接种环挑取平板上的单个菌落,与生理盐水混匀,室温下自然干燥后经火焰固定。在干燥固定后的涂片上,滴加草酸铵结晶紫染色液进行初染,1分钟后水洗;滴加革兰氏碘溶液于涂片上媒染,1分钟后,水洗;再加95%酒精进行脱色,30s后水洗;最后滴加石碳酸复红进行复染,约1分钟后水洗,自然干燥。在显微镜下观察细菌形态,革兰氏阳性菌呈蓝紫色,革兰氏阴性菌呈粉红色。

1.2.3  生化鉴定

依据以上试验的结果,分别对纯化的各菌株进行生化试验鉴定:取疑似链球菌进行CAMP试验和糖发酵试验,七叶苷水解试验等;取疑似大肠杆菌进行生化鉴定,包括MR、枸橼酸盐、VP、吲哚、糖发酵等试验[9]

1.2.4 药敏试验

纸片扩散法:在无菌室超净台上,用无菌镊子取出药敏纸片并均匀的贴在涂有细菌的平皿培养基表层,用镊子轻按几下药敏片使药敏片与培养基紧密相贴。将准备好的药敏片按顺序依次均匀平铺在琼脂平板上,做好标记,放在生化培养箱里37恒温培养24h后,取出培养皿测量抑菌圈直径,记录好药敏试验的结果。判定标准是:抑菌圈直径在010 mm的为不敏感;1015 mm的为中度敏感;1520 mm的为高度敏感;大于20 mm的为极度敏感[10]

1.2.5 药物治疗

根据药敏试验结果,选择高敏药物复方阿莫西林和头孢氨苄对患乳房炎的8头奶牛分别进行治疗,每头每次肌肉注射复方阿莫西林注射液(规格12g12g和静脉注射头孢氨苄注射液(规格10g10g,每天一次,连用3天。

2 结果与分析

2.1 细菌分离鉴定结果

7份奶样中一共分离到8个菌株,其中A类细菌3株,在营养琼脂上长有灰白色、边缘整齐、隆起、光滑湿润、圆形菌落,在麦康凯琼脂和伊红美蓝琼脂上分别形成红色菌落和亮黑色菌落,在血琼脂上不生长;B类细菌5株,在营养琼脂上生长状况不好,在麦康凯琼脂和伊红美蓝琼脂上不能生长,在血琼脂平板上生长淡灰色、黏稠、隆起的菌落,并溶血。

22 镜检结果

将分离培养的两种细菌分别涂片染色镜检:A菌粉红色,为革兰氏阴性菌,两端钝圆,中等大小细长杆菌;B菌蓝紫色,为革兰氏阳性菌,呈短链、长链的球菌。

2.3 生化试验结果

1  生化试验与结果

项目

麦芽糖

枸橼酸盐试验

吲哚

MR试验

硫化氢

甘露醇

七叶苷

山梨醇

V-P试验

马尿酸钠

 

A

 

 

B

 

+

 

 

 +

 

-

 

 

 

 

 

+

 

 

 

 

 

+

 

 

 

 

 

-

 

 

 

 

 +

 

 

 -

 

-

 

 

-

 

-

 

 

-

 

-

 

 

 +

 

 

 

 

 

+

 

注:“+”为阴性;“-”为阳性;空白表示未做试验。

    根据培养形态,染色特性以及生化试验结果,可初步判定所分离菌中A为无乳链球菌,B为大肠杆菌。

2.4 药敏试验结果

2  药敏试验结果

抗菌药物

A类细菌                B类细菌

阿莫西林

链霉素

青霉素

头孢氨苄

红霉素

新霉素

头孢唑啉

氨苄青霉素

庆大霉素

丁胺卡那霉素

恩诺沙星

                22                     27

                18                     17

                 2                     15

                18                     26

                10                     17

                 7                     6

                19                     22

                13                     7

                22                     18

                18                     8

                22                     18

强力霉素   

磺胺甲噁唑

呋喃唑酮

复方磺胺TMP

                 7                     13  

3                     11

10                      8

7                     13

注:抑菌圈直径(㎜)

对分离菌株分别用15种药物做药敏试验,从表2可看出,在这15种抗菌药中青霉素、磺胺类药物对其几乎无抑菌作用;氨苄青霉素、新霉素和丁胺卡那霉素抑菌圈直径在中敏范围内说明具有较好的抑菌效果;头孢氨苄和复方阿莫西林的抑菌圈直径最大说明它们对大肠杆菌和无乳链球菌最敏感。

2.5 药物治疗结果

用药3天后,观察到8头患病牛乳区红肿消失,乳中无凝块,乳色正常,7天后再观察8头病牛没有复发现象。治愈率100%

3 讨论

本试验经过对病原菌的分离培养、生化特性、形态染色特性等鉴定,结果可以看出检测的7份奶样里分离出的8个菌株中有3个为大肠杆菌,5株是无乳链球菌,与国内胡松华等[10]报道基本上一致。本试验检出的病原菌主要是无乳链球菌,与卢体康等[11]报道些许有点差异。此次试验的结果也有一些局限性,因为试验样品有点少。药敏试验结果中可优先考虑复方阿莫西林和头孢氨苄这些药物做临床上的治疗,因为它们对大肠杆菌和无乳链球菌最敏感;对于丁胺卡那霉素、氨苄青霉素和新霉素也可以考虑配合使用因为它们有良好的抑菌效果;磺胺类药物、青霉素抑菌效果最差几乎无效,临床治疗用药时这些药物就可以不考虑了。

引起乳房炎的因素有很多,除了与病原菌直接相关外,还与保健措施、奶牛健康状况、饲养管理状况、卫生条件等多种因素有关,因此,要从根本上控制奶牛乳房炎,在科学的药物治疗的同时,还必须有积极的综合性防治办法:制定合理的挤奶制度:挤奶前可以用0.1%高锰酸钾液,0.1%的新洁尔灭,2.5%-7.5%的碘液等消毒液清洗乳房和乳头,药浴乳头可用1%碘伏溶液或其他药浴液,药浴10-20秒后擦干乳头,在第一泌乳期和第二泌乳期的乳牛挤奶前药浴乳头效果是最好[12]。挤奶要把乳汁挤干净,冬天乳头可涂适量凡士林防干裂,夏天在挤完乳后用药浴液浸泡奶头,药浴能有效的减少致病菌的感染[13,1415]搞好环境卫生:牛舍内保持干燥通风,粪便及时清理,投喂饲料时掉落的散料及时清理,粪便更要及时清理,尤其是夏季。做好奶牛乳房炎的检测诊断:尽可能做到早发现早治疗以提高治愈率。不仅是在挤奶的时候,饲喂奶牛时也要多加注意奶牛乳房,一旦发现病牛要及时隔离,然后尽快治疗,以免病原扩散,感染其他牛只。加强饲养管理:制定科学的饲养管理办法,用科学的饲养标准和制度养牛,对奶牛进行全价饲养。

4 结论

本试验分离出8株细菌,无乳链球菌有5株,大肠杆菌有3株。用15种药物对这8株细菌进行敏感性试验,结果表明, 复方阿莫西林和头孢氨苄对大肠杆菌和无乳链球菌最敏感。该奶牛场选择复方阿莫西林、头孢氨苄为临床治疗场内奶牛乳房炎的药物,最终取得了良好的治疗效果,有效控制病情。

参考文献(略)

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